防脱片的处理

脱片是免疫组织化学中经常遇到的问题(尤其是脑组织冰冻切片)，一般来说脱片主要有以下几种原因：

 

1. 组织固定、脱水、透明不充分

 

2．组织切片过厚

 

3．组织切片有折叠

 

4．过度的热抗原修复(高压、微波、水煮)处理或抗原修复液的pH偏高

 

5．操作过程中，冲洗方法不正确等

 

在实际操作的过程中，除了要注意以上几点之外，防脱片的应用是很有必要的，市售的防脱载玻片一般为正电荷玻片，不同品牌之间品质存在差异，而即使是较好的PREMIER玻片其防脱效果有时也不能令人满意，而且假货较多

 

因此，实验室常常需要自己处理防脱载玻片，步骤如下：

 

1.  玻片的酸处理

 

使用实验室常用的次强酸清洁液（重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml）浸泡玻片24小时，流水充分冲洗后在用蒸馏水冲洗三遍，置于95%乙醇中浸泡12小时，取出放烘箱中烤干或自然风干。

 

2.   黏附剂的使用

 

目前常用的黏附剂有三种：明胶-硫酸铬钾，APES（3—氨丙基—乙氧基甲硅烷），多聚左旋赖氨酸（poly-1—lysine）

 

（1）  明胶-硫酸铬钾，这种方法十分简便实用，不仅用于传统染色，而且能够用于免疫组化、原位杂交等检测，目前实验室大多数时候可以常规用该黏附剂。该方法的美中不足是在pH值高于8.0的碱性环境中（如使用PH9.0的TE抗原修复液）加温到80度以上，切片还是容易脱落，因此选用此种黏附剂时宜采用PH6.0的柠檬酸钠抗原修复液。

 

配制方法：将5g明胶溶解于1L热的蒸馏水中，待冷却后加入0.5g硫酸铬钾充分搅拌溶解，将玻片浸泡其中30分钟，取出自然晾干后再次浸泡30分钟，晾干装盒备用。如果效不能满足需要，可将浓度提高一倍，即10g明胶+1g硫酸铬钾/L。（更高的浓度本实验室未做尝试）

 

（2）  APES（3—氨丙基—乙氧基甲硅烷）要用丙酮稀释，而丙酮有导致肝硬化的作用，需注意人身防护。方法弥补了部分高温碱性溶液脱片的问题。另外，有说法认为已经贴好的片子如果有脱片现象，可用此法浸泡3分钟，晾干后进行下一步，但经本实验室验证效果并不好。

 

配制方法：将APES用丙酮稀释（APES:丙酮=1:50），洗净的玻片浸入溶液中20秒，取出控去多余溶液，再浸入纯丙酮或蒸馏水中洗去未结合的APES，晾干装盒备用。（注意：此溶液需现用现配，因此尽量一次批量处理尽可能多的玻片以充分利用）。

 

（3）  多聚左旋赖氨酸（poly-1—lysine），这种方法相当昂贵。但是，如果进行高压碱性修复，可能总体上效果是最佳的。普通组化实验和免疫组化酸性修复（大多数的情况）则没有必要常规使用。多聚赖氨酸一般常见的分子量有70,000～150,000，150,000～300,000和>300,000，分子量越大，黏附力越强，但相对完全溶解较困难。

 

配制方法：按照0.1mg/ml的浓度用双蒸水溶解多聚赖氨酸，将洗净的玻片尽在溶液中5分钟（增加时间不会提高粘附效果），自然晾干装盒备用。如果要节约试剂，可使用直接涂布法，用移液器吸取溶液涂布于玻片上需要贴片的区域，可随意控制面积大小，一般用量控制在20μl/cm2。（注意：1.浸泡法每100ml多聚赖氨酸溶液包被的片子一般不超过100张，包被过多会降低粘附力。2.多聚赖氨酸溶液4℃保存，一年内稳定。3.冰箱内取出的多聚赖氨酸溶液使用前要先恢复到室温方可正常使用）。